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dna鉴定机械

发布时间:2022-11-21 点击:25次

DNA的粗提取与鉴定怎么做!

1.DNA的释放:DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了开云全站app使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2.将DNA与蛋白质分离:根据二者的特性,即在浓度较高的NaCl溶液(物质的量浓度为2

mol/L)中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在

浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高,Na

与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈现溶解状态。

3.DNA的析出与获取:利用DNA在浓度较低的NaCl溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的NaCl溶液中加入大量(300

mL)蒸馏水,稀释NaCl溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4000

r/min

的旋转频率,离心15

min

,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。

4.DNA的再溶解:再用较高浓度的NaCl溶液去溶解DNA黏稠物。

5.DNA的沉淀和浓缩:除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na

的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。

6.DNA的鉴定:本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成w—羟基—r酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。

鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

细胞DNA的提取一般用什么方法

高中:原理:

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。方法步骤:

1.提取细胞核物质:顺时针方向搅拌,稍快,稍重。

5

min

2.溶解DNA:

3.析出含DNA的黏稠物:蒸馏水300mL,逆时针方向搅拌,缓慢

4.过滤:取黏稠物

5.再溶解:顺时针方向搅拌,较慢。3

min

6.过滤:取滤液。

7.提取出含杂质较少的DNA,逆时针方向搅拌,稍慢。5

min

8.DNA的鉴定:沸水浴5min

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DNA提取分为三个基本步骤,每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞;③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.

利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M

纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的

氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA

钠盐沉淀出来.

B.

也可用0.15

MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA

时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA

的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA

的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.

(2).阴离子去污剂法;

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA

.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

(3).苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA

联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA

的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA

。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%

,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

DNA的提取与鉴定?

1.材料制备

0.1g/ml柠檬酸钠100ml

500ml烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min离心2min→吸去上清液→

活鸡血180ml

即得鸡血细胞液(也可将上述烧杯置于冰箱中,静置一天使鸡血细胞自行沉淀)

2.方法步骤

取血细胞液5-10ml+20ml蒸馏水,玻璃棒沿一个方向快速搅拌

(1)提取血细胞核物质

纱布过滤,滤液中含dna和其他核物质,如蛋白质

原理:血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破,玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂

(2)溶解核内dna:滤液+2mol/lnacl溶液40ml,玻璃棒沿一个方向搅拌

(3)析出含dna的粘稠物:向上述溶液中缓缓加入蒸馏水,并轻轻地沿一个方向搅拌,出现丝状物,当丝状物不再增加时,停止加水(此时nacl溶液相当于稀释到0.14mol/l)

(4)滤取含dna的粘稠物:用多层纱布过滤,含dna的粘稠物留在纱布上

(5)dna粘稠物再溶解:

20ml2mol/lnacl溶液

50ml烧杯,

上述粘稠物

缓慢搅拌3

min

(6)过滤含dna的2mol/lnacl溶液:用2层纱布过滤,滤液中含dna

(7)提取含杂质较少的dna:上述溶液+95%酒精,缓慢搅拌,出现乳白色丝状物,用玻璃棒将丝装物卷起。

(8)dna鉴定:

实验关键:

本实验成功的关键是获取较纯净的dna,因此应注意:

1.充分搅拌鸡血细胞液。dna存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后,应用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使血细胞加速破裂,并释放出dna

2.沉淀dna必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精,并在冰箱中(5℃以下)至少存放24小时。

3.正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第(3)、(5)步骤,玻璃棒不要直插烧杯底部,且搅拌要轻缓,以便获得较完整的dna分子。在步骤(7),要将玻璃棒插入烧杯溶液中间,用手缓慢转动5-10min。

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